WESTERN BLOTTING E RIVELAZIONE DELLE BANDE IMMUNOREATTIVE

In questa giornata di laboratorio abbiamo evidenziato le bande immunoreattive.

Procedimento:

•       Incubazione (in oscillazione) della membrana con Albumina Serica Bovina (BSA) 1% in PBS con 0,05% TWEEN 20 (c.a. 1 dito) per 45 min. a temperatura ambiente.

•       2 lavaggi in PBS con 0,05% TWEEN 20 della durata di 5 min. ciascuno.

•       Incubazione con streptavidina coniugata con la perossidasi (HRP) 1:10000 in PBS con 0,05% TWEEN 20 per 45 min. a temperatura ambiente.

•       3 lavaggi in PBS con 0,05% TWEEN 20 della durata di 5 min. ciascuno.

•       Sviluppo con 4-Cloro Naftolo.

Preparazione della soluzione stock di 4-Cloro Naftolo in Etanolo: Solubilizzare una compressa di 4-Cloro Naftolo da 30 mg in 10 ml di Etanolo (ATTENZIONE: Lavorare sotto cappa chimica).

Preparazione della soluzione di sviluppo:Aggiungere 5 ml della soluzione stock di 4-Cloro Naftolo in Etanolo a 20 ml di TRIS-HCl  0,05 M pH 6,8 e 7µl di H₂O₂ 30% (ATTENZIONE: Lavorare sotto cappa chimica).

La soluzione così preparata va utilizzata immediatamente e per il tempo strettamente necessario ad evidenziare gli immunocomplessi antigene-anticorpo (colorazione blu-violacea delle bande immunoreattive); terminato lo sviluppo va allontanata e la membrana lavata più volte con acqua ultrapura  per allontanare i residui della soluzione di sviluppo.

Autori: Roberta e Sara

Colonie di Saccharomyces Cerevisiae
seminate tre giorni prima

Calcolo del Peso Molecolare delle proteine
 dopo la corsa elettroforetica

ELETTROFORESI SDS PAGE

Dopo aver calcolato la concentrazione delle proteine nel campione le andiamo a separare.

Ogni proteina ha un determinato peso molecolare, perciò le separeremo in base a questo.

L'elettroforesi è una tecnica che permette di separare molecole presenti in soluzione in forma ionizzata, applicando un campo elettrico. La separazione si basa sulla loro differente velocità di migrazione, queste molecole possono essere proteine, amminoacidi, acidi nucleici, nucleotidi o peptidi.

Noi abbiamo fatto l’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) utilizzando il sodio dodecil solfato (SDS). L’SDS elimina la differenza di carica elettrica e la forma delle proteine, il questo modo possiamo separarle solo in funzione del loro peso molecolare.

PROCEDIMENTO:

·         Assemblare i vetrini per creare la camera dove dovrà essere versata la soluzione

·         Preparare il Separating Gel (12%gel - 0,375 Tris pH8,8)

Acqua	3,35ml
Tris-Hcl1,5M pH8,8	2,5ml
SDS 10% w/v	100µl
Soluzione acrilamide/bis	4ml
Ammonio persolfato 10%	50µl
TEMED	5µl
	V tot ≈ 10ml

Attenzione: L’Ammonio persolfato e il TEMED sono rispettivamente il catalizzatore e l’iniziatore della reazione di polimerizzazione e la loro aggiunta farà subito iniziare la formazione dei legami tra i monomeri di acrilamide e tra questi e la bis, quindi vanno aggiunti per ultimo e bisogna procedere rapidamente a versare la soluzione tra i vetrini.

·         Versare il Separating Gel tra i due vetrini fino ad arrivare a c.a. 1 cm sotto al limite inferiore del pettine.
Sopra alla soluzione poniamo Isobutanolo saturo con acqua per eliminare le bolle e far in modo che il gel sia livellato perfettamente.
Il tempo di polimerizzazione è di c.a. 1 ora.

·         Finita la polimerizzazione togliere l’isobutanolo aspirandolo con una Pipetta Pasteur e asciugare le pareti con un pezzo di carta assorbente.

·         Preparare lo Staking Gel (4%gel - 0,125M Tris pH 6,8)

Acqua	6,1ml
Tris-Hcl0,5M pH6,8	2,5ml
SDS 10% w/v	100µl
Soluzione acrilamide/bis	1,33ml
Ammonio persolfato 10%	50µl
TEMED	10µl
	V tot ≈ 10ml

·         Agg. Lo Staking Gel fino all’orlo della camera e inserire il pettine per creare i pozzetti dove andremo poi a depositare i campioni da separare.

·         A polimerizzazione avvenuta estrarre il pettine facendo attenzione a non rompere i pozzetti. Lavare i pozzetti con running buffer (3-4 volte) e riempirli con il running buffer.

·         Preparazione del campione:
Sapendo la concentrazione del campione dall’esperienza di laboratorio precedente (calcolata tramite lo spettrofotometro) Prelevare 20µg di proteine dal campione, diluirli 1:4 con sample buffer e scaldarlo a 95°C per 5 min. (per denaturare le proteine).

• Deporre lo standard (contenente proteine di peso molecolare noto) e i campioni nei pozzetti (vol. max 10µl).

·         Assemblare la cella e riempire le vaschette interna ed esterna con running buffer. Chiudere la cella con il coperchio e inserire gli spinotti nell’alimentatore.
La corsa viene effettuata a t°ambiente, per c.a. 1 ora a 180 V (la corsa è terminata quando il fronte del blu di bromofenolo arriva in fondo al gel).

·         Terminata la corsa elettroforetica il gel viene lavato con acqua e quindi fissato per 1 ora.

Fissaggio per colorazione con Coomassie Brilliant Blue:

Metanolo        40%

Acido acetico  10%

Acqua               50%

Il gel viene poi colorato con Coomassie Brilliant Blue.

Come fare l'elettroforesi SDS Page --> Video



Autori: Roberta e Sara

Inizia la corsa!

Bello questo gel...

Preparazione della cella

Momenti di pazzia... XD

 

Maria Emilia che controlla la corsa!

DETERMINAZIONE DELL'ETANOLO - metodo enzimatico spettrofotometrico

In questa esperienza determiniamo la concentrazione di etanolo presenti nei nostri lieviti,
Il principio del metodo che abbiamo utilizzato, è di ossidare tutto l'etanolo presente ad acetaldeide con nicotamide-adenina dinucleotide (NAD). La reazione viene catalizzata da alcool deidrogenasi.

L'acetaldeide viene ossidata in fine ad acido acetico in presenza di aldeide deidrogenasi.

Il NADH formatosi viene misurato per via spettrofotometrica, misurando l'assorbanza a 334, 340 o 365 nm.
questa esperienza è stata fatta con reagenti già preparati, il pacchetto formato da:

• bottiglia da 100 ml di soluzione contenente tampone fosfato a pH 9
• 30 compresse che contengono 4 mg di NAD e 08 U di aldeide deidrogenasi 
• bottiglia che contiene 1,6 ml di sospensione id alcool deidrogenasi

Preparazione dei reagenti.

usare il contenuto della prima bottiglia non diluito, sciogliere (in una provetta) una compressa di NAD in 3 ml della soluzione della prima bottiglia. preparare 1 provetta per ogni prova. 

	Bianco	Standard	Campione
Miscela di reazione 2	3,000 μl	3,000 μl	3,000 μl
Acqua distillata	0,100 μl	˗	˗
Campione	˗	˗	0,100 μl
Sol. Std di etanolo 0,058 g/l	˗	0,100 μl	˗
Agitare, dopo 3 min. leggere assorbimento a 340 nm e agg.
Sospensione	0,050 μl	0,050 μl	0,050 μl

Dopo circa 10 minuti la reazione è completamente avvenuta si legge l'assorbanza. Per far si che la nostra lettura sia accurata il campione non deve contenere più di 0,060 g/l di etanolo, se supera questa concentrazione bisogna diluirlo.















Per concludere l'esperienza abbiamo calcolato la concentrazione nello standard e nel campione.

Autori: Roberta e Sara

DOSAGGIO DELLE PROTEINE - METODO DI BRADFORD

In questa nuova esperienza abbiamo calcolato la concentrazione delle proteine nei nostri campioni, precedentemente preparati nell'esperienza di estrazione delle proteine dal lievito. 

Il metodo da noi usato prevede l'utilizzo del reattivo di Bradford (Coomassie Brillant Blue G250, preparato in precedenza) e dello spettrofotometro.

Per iniziare abbiamo fatto una retta di taratura a concentrazioni note, quindi abbiamo perparato un bianco, e 4 standard (25, 50, 75, 100 µg) 

Preparazione del bianco

• 0,100 ml acqua
• 5 ml di reattivo di Bradford

Preparazione dei campioni

	STD 25 µg	STD 50 µg	STD 75 µg	STD 100 µg
BSA 1mg/ml	0,025 ml	0,050 ml	0,075 ml	0,100 ml
Acqua	0,075 ml	0,050 ml	0,025 ml
Reattivo di Bradford	5 ml	5 ml	5 ml	5 ml

BSA - Seralbumina bovina (proteine a conc. nota)

Preparazione del campione

•  0,090 ml di acqua
• 0,010 ml di campione
• 5 ml di reattivo di Bradford

Agitare, aspettare 5 minuti e poi effettuare la lettura allo spettrofotometro a lunghezza d'onda 595 nm

Una volta ottenuti i risultati si disegna una rette di taratura con gli standard.

Assorbanza	Concentrazioni
0,14254	0,025
0,35221	0,05
0,4952	0,075
0,53272	0,1
Ass. incognite	Conc. incognite
0,1956	0,027273938		conc. Roby
0,24432	0,036546697		conc. Sara

Trovata la concentrazione che sta in 10 ml del campione si trova quante proteine ci sono in un millilitro.

10 ml : 36,54 µ = 1 ml : x

x = (36,54 µg * 1 µl) / 10 µl = 3,654 µg/µl

Autori: Roberta e Sara

ESTRAZIONE DELLE PROTEINE DALLE CELLULE DI LIEVITO

In questa nuova esperienza abbiamo estratto le cellule di lievito dalla coltura cellulare, le abbiamo rotte ed abbiamo estratto le proteine.

Le cellule di lievito utilizzate sono Saccaromyces Cerevisiae del ceppo K310.

PROCEDIMENTO:

· Mettere  in una falcon 10ml di coltura cellulare (coltura cellulare su terreno liquido) e centrifugare a 3000G per 10 min. per separare le cellule dal terreno di coltura.

· Togliere il supernatante capovolgendo la falcon (le cellule restano compattate sul fondo) ed agg. H₂O distillata (il triplo rispetto al volume delle cellule) per togliere il residuo di terreno rimasto, mescolare le cellule e l’acqua “spipettando” con una pipetta Pasteur . Centrifugare a 3000G per 5 min. per separare le cellule dall’acqua.

· Togliere il supernatante (l’acqua) capovolgendo la falcon ed agg. Il tampone MES-TRIS a pH 6 (il triplo rispetto al volume delle cellule), mescolare “spipettando”. Centrifugare a 3000G per 5 min.

· Togliere il supernatante (il tampone) capovolgendo la falcon ed agg. Glass beads (microsfere di vetro) in ugual volume rispetto alle cellule e, tampone MES-TRIS a pH 6, PI e PMSF in rapporto 98:1:1 il doppio rispetto al volume delle cellule. Miscelare nel vortex per 8 min. alternando 30 secondi nel vortex e 30 secondi in bagno di ghiaccio.

· Aspirare la parte liquida poggiando la pipetta Pasteur sul fondo della falcon (per non aspirare anche le microsfere), mettere la parte aspirata contenente cellule, proteine e tampone in una nuova falcon e centrifugare a 300G per 5 min.

Aspirare con una pipetta il supernatante contenente le proteine e metterlo in un’eppendorf.

Cellule (pellet) e Proteine (supernatante)

eppendorf con le proteine

N.B. Durante tutta la procedura tenere sempre, nei tempi morti, la falcon contenente le cellule in bagno di ghiaccio!

Bagno di ghiaccio

Semina su terreno di Saccaromices Cerevisiae K310

Autori: Roberta e Sara