PREPARAZIONE DI SOLUZIONI PER DETERMINARE LE PROTEINE NEI LIEVITI

In questa nuova esperienza in laboratorio ci sono servite diverse soluzioni, tra cui il Reattivo di Bradford G-250, il TRIS-HCl e il MES-TRIS e  Sample baffer SDS-PAGE.

Reattivo di Bradford.
Per preparare si scioglie:
-10 mg di Coomassie Brillant Blue G-250
-5 ml di etanolo al 95%
-aggiungere 10 ml di acido ortofosforico 85%
-si porta al volume di 100 ml con acqua.
Si filtra la soluzione sotto cappa chimica con un filtro a pieghe.






Il reattivo di Bradford sfrutta la spettroscopia ad assorbimento per determinare la concentrazione di proteine in composti biologici. Infatti il Coomassie BB nel campo di assorbimento visibile, ha lunghezza d’onda massima e di 465 nm, mentre se forma il complesso con le proteine la lunghezza d’onda è di 595 nm.

TRS-HCl 1,5M Ph 8,8



In un falcon si preparano 40 ml di soluzione, si pesa 7,27 g di TRIS, grazie al pHametro portiamo la soluzione a pH 8,8 con l’aggiunta di acido cloridrico, si porta a volume con 100ml di acqua.

SDS 10% in acqua

In una falcon si pesa 1 g di SDS e si scioglie in 10 ml di acqua. Questa operazione deve essere fatta con attenzione, data la natura del SDS di denaturare le cellule, quindi si utilizza la maschera e guanti!

TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8

In una falcon si preparano 40 ml di soluzione, si pesano 2,42 g di TRIS e portiamo la soluzione a pH 6,8 con acido cloridrico, e poi si porta a volume di 100 ml con acqua.

MES 50 mM / TRIS pH 6

per preparare questa soluzione si usa una falcon, si pesa 0,39 g di MES, e si porta a pH 6 con l'aggiunta di TRIS, si porta a 100 ml con l'acqua.

Per ultimo si prepara parzialmente la soluzione per denaturare i campioni, Sample baffer SDS-PAGE sec. Laemmli.

Per preparare questa soluzione si usano:

• acqua deionizzata 0,380 mL
• TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8 0,100 mL
• glicerolo 0,080 mL
• SDS 10% 0,160 mL
• 1% blue bromofenolo 0,040 mL

solo quando viene utilizzato si aggiunge 0.040 mL di 2-mercaptoetanolo.

Autori: Roberta e Sara