ESTRAZIONE DELLE PROTEINE DALLE CELLULE DI LIEVITO

In questa nuova esperienza abbiamo estratto le cellule di lievito dalla coltura cellulare, le abbiamo rotte ed abbiamo estratto le proteine.

Le cellule di lievito utilizzate sono Saccaromyces Cerevisiae del ceppo K310.

PROCEDIMENTO:

· Mettere  in una falcon 10ml di coltura cellulare (coltura cellulare su terreno liquido) e centrifugare a 3000G per 10 min. per separare le cellule dal terreno di coltura.

· Togliere il supernatante capovolgendo la falcon (le cellule restano compattate sul fondo) ed agg. H₂O distillata (il triplo rispetto al volume delle cellule) per togliere il residuo di terreno rimasto, mescolare le cellule e l’acqua “spipettando” con una pipetta Pasteur . Centrifugare a 3000G per 5 min. per separare le cellule dall’acqua.

· Togliere il supernatante (l’acqua) capovolgendo la falcon ed agg. Il tampone MES-TRIS a pH 6 (il triplo rispetto al volume delle cellule), mescolare “spipettando”. Centrifugare a 3000G per 5 min.

· Togliere il supernatante (il tampone) capovolgendo la falcon ed agg. Glass beads (microsfere di vetro) in ugual volume rispetto alle cellule e, tampone MES-TRIS a pH 6, PI e PMSF in rapporto 98:1:1 il doppio rispetto al volume delle cellule. Miscelare nel vortex per 8 min. alternando 30 secondi nel vortex e 30 secondi in bagno di ghiaccio.

· Aspirare la parte liquida poggiando la pipetta Pasteur sul fondo della falcon (per non aspirare anche le microsfere), mettere la parte aspirata contenente cellule, proteine e tampone in una nuova falcon e centrifugare a 300G per 5 min.

Aspirare con una pipetta il supernatante contenente le proteine e metterlo in un’eppendorf.

Cellule (pellet) e Proteine (supernatante)

eppendorf con le proteine

N.B. Durante tutta la procedura tenere sempre, nei tempi morti, la falcon contenente le cellule in bagno di ghiaccio!

Bagno di ghiaccio

Semina su terreno di Saccaromices Cerevisiae K310

Autori: Roberta e Sara