DIGESTIONE DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

In questa esperienza useremo enzimi di restrizione Alu1 (taglia sequenza composta da 4 nucleotidi specifici).
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Per preparare la digestione servono:

• 1µg DNA              20µl DNA (50µg/x)          50 mg/µl =>1000 mg 
• 1 x Buffer               5µl Buffer
• 1 µg Alu                 1µl enzima 
• 50µl H₂O   finali  24µl H₂O

Quindi nell'eppendorf si aggiunge per primo il volume più grande al più piccolo.

• si centrifuga per un minuto
• si riscalda a 37°C per un ora (questo attiverà l'enzima e a fare in modo che tagli le sequenze)

Nel frattempo si prepara il gel di agarosio per l'elettroforesi. Si pesano 1,4 g di agarosio e 70 ml di T.A.E. (TRIS, HCl e EDTA) diluito, Si prelevano 10 ml di TAE 50x e si porta a volume di 500 ml.

Si scalda la beuta contenente 1,4 g di gel e 70 ml T.A.E., finché l'agarosio non si è sciolto completamente, versare il liquido nella vaschetta elettroforetica, si tolgono le bolle in superficie e si lascia solidificare. 

 Si prepara i campioni per l'elettroforesi:

1. campione PCR; 18 µl DNA + 2 µl di loading
2. campione con enzima di restrizione: 18 µl DNA + 2 µl di loading

Caricare sul gel 20 µl dei campioni nei pozzetti. Si far partire l'elettroforesi a 80 Volt per c.a. 20 minuti.

Autori: Roberta e Sara