Concentrazione DNA
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| DNA Estratto |
Dopo aver
estratto il DNA dalle cellule lo abbiamo quantificato determinando la
concentrazione con lo spettrofotometro.
Gli acidi
nucleici del DNA assorbono la luce UV con un picco di assorbimento ad una
lunghezza d’onda di 260 nm.
PROCEDIMENTO:
- Prelevare 0,98ml di H2O Milli-Q e metterla in un’eppendorf.
- Prelevare 2µl di DNA precedentemente estratto ed aggiungerlo nell’eppendorf con l’H2O.
- Preparare il “Bianco” con 1ml di H2O Milli-Q.
- Misurare allo spettrofotometro.
50µg di DNA
hanno un’assorbanza pari a 1
Calcolare la
concentrazione facendo il rapporto
1 : 50 µg = (assorbanza campione) : X
La X
ricavata è la quantità di DNA, espressa in µg, contenuta nel campione.
Trovare la
concentrazione µg /µl
X · 500 (fattore di diluizione) : 1000 (conversione da L a ml)
PCR (Reazione a Catena dellaPolimerasi)
La PCR è una
tecnica che permette di ottenere “in vitro” numerose copie di un particolare
tratto di DNA di interesse a partire da una preparazione eterogenea di DNA.
Per far
avvenire la reazione è necessario avere:
DNA di
partenza.- Una Polimerasi termoresistente in grado di funzionare anche a temperature elevate (la più comune è la Taq polimerasi, isolata dal batterio Thermophilus Aquaticus).
- Desossiribonucleotidi trifosfati (dNTP) da polimerizzare.
- Due Oligonucleotidi sintetici di 20-30 nucleotidi (primer) che funzionano da inneschi della reazione. - Questi indirizzano la polimerasi a sintetizzare una regione specifica di DNA.
PROCEDIMENTO:
- Portare il DNA a conc. 50ng/ µl
- Mettere la diluizione in un’eppendorf.
- Mettere in una nuova eppendorf:
V da agg.
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100ng DNA 0,1 µg
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2 µl
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1 x Buffer 10x
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5 µl
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200µM dNTP (10nM)
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1 µl
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0,2µM Primer Forward
(10µM)
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1 µl
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0,2µM Primer Reverse (10µM)
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1 µl
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2,5µl Taq polimerasi
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2,5 µl
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Volume
finale = 50 µl (volume raggiunto con H2O)
- Mettere prima l’H2O Milli-Q (37,5 µl) , poi tutto il resto, mettendo per ultimo l’enzima Taq polimerasi.
- Mettere l’eppendorf nella macchina per la PCR.
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| PCR |
Autori: Roberta e Sara
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| Cellule viste al microscopio a Fluorescenza |
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