WESTERN BLOTTING E RIVELAZIONE DELLE BANDE IMMUNOREATTIVE

In questa giornata di laboratorio abbiamo evidenziato le bande immunoreattive.

Procedimento:

•       Incubazione (in oscillazione) della membrana con Albumina Serica Bovina (BSA) 1% in PBS con 0,05% TWEEN 20 (c.a. 1 dito) per 45 min. a temperatura ambiente.

•       2 lavaggi in PBS con 0,05% TWEEN 20 della durata di 5 min. ciascuno.

•       Incubazione con streptavidina coniugata con la perossidasi (HRP) 1:10000 in PBS con 0,05% TWEEN 20 per 45 min. a temperatura ambiente.

•       3 lavaggi in PBS con 0,05% TWEEN 20 della durata di 5 min. ciascuno.

•       Sviluppo con 4-Cloro Naftolo.

Preparazione della soluzione stock di 4-Cloro Naftolo in Etanolo: Solubilizzare una compressa di 4-Cloro Naftolo da 30 mg in 10 ml di Etanolo (ATTENZIONE: Lavorare sotto cappa chimica).

Preparazione della soluzione di sviluppo:Aggiungere 5 ml della soluzione stock di 4-Cloro Naftolo in Etanolo a 20 ml di TRIS-HCl  0,05 M pH 6,8 e 7µl di H₂O₂ 30% (ATTENZIONE: Lavorare sotto cappa chimica).

La soluzione così preparata va utilizzata immediatamente e per il tempo strettamente necessario ad evidenziare gli immunocomplessi antigene-anticorpo (colorazione blu-violacea delle bande immunoreattive); terminato lo sviluppo va allontanata e la membrana lavata più volte con acqua ultrapura  per allontanare i residui della soluzione di sviluppo.

Autori: Roberta e Sara

Colonie di Saccharomyces Cerevisiae
seminate tre giorni prima

Calcolo del Peso Molecolare delle proteine
 dopo la corsa elettroforetica