bchemity: ELETTROFORESI SDS PAGE

Dopo aver calcolato la concentrazione delle proteine nel campione le andiamo a separare.

Ogni proteina ha un determinato peso molecolare, perciò le separeremo in base a questo.

L'elettroforesi è una tecnica che permette di separare molecole presenti in soluzione in forma ionizzata, applicando un campo elettrico. La separazione si basa sulla loro differente velocità di migrazione, queste molecole possono essere proteine, amminoacidi, acidi nucleici, nucleotidi o peptidi.

Noi abbiamo fatto l’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) utilizzando il sodio dodecil solfato (SDS). L’SDS elimina la differenza di carica elettrica e la forma delle proteine, il questo modo possiamo separarle solo in funzione del loro peso molecolare.

PROCEDIMENTO:

· Assemblare i vetrini per creare la camera dove dovrà essere versata la soluzione

· Preparare il Separating Gel (12%gel - 0,375 Tris pH8,8)

Acqua	3,35ml
Tris-Hcl1,5M pH8,8	2,5ml
SDS 10% w/v	100µl
Soluzione acrilamide/bis	4ml
Ammonio persolfato 10%	50µl
TEMED	5µl

	V tot ≈ 10ml

Attenzione: L’Ammonio persolfato e il TEMED sono rispettivamente il catalizzatore e l’iniziatore della reazione di polimerizzazione e la loro aggiunta farà subito iniziare la formazione dei legami tra i monomeri di acrilamide e tra questi e la bis, quindi vanno aggiunti per ultimo e bisogna procedere rapidamente a versare la soluzione tra i vetrini.

· Versare il Separating Gel tra i due vetrini fino ad arrivare a c.a. 1 cm sotto al limite inferiore del pettine.
Sopra alla soluzione poniamo Isobutanolo saturo con acqua per eliminare le bolle e far in modo che il gel sia livellato perfettamente.
Il tempo di polimerizzazione è di c.a. 1 ora.

· Finita la polimerizzazione togliere l’isobutanolo aspirandolo con una Pipetta Pasteur e asciugare le pareti con un pezzo di carta assorbente.

· Preparare lo Staking Gel (4%gel - 0,125M Tris pH 6,8)

Acqua	6,1ml
Tris-Hcl0,5M pH6,8	2,5ml
SDS 10% w/v	100µl
Soluzione acrilamide/bis	1,33ml
Ammonio persolfato 10%	50µl
TEMED	10µl

	V tot ≈ 10ml

· Agg. Lo Staking Gel fino all’orlo della camera e inserire il pettine per creare i pozzetti dove andremo poi a depositare i campioni da separare.

· A polimerizzazione avvenuta estrarre il pettine facendo attenzione a non rompere i pozzetti. Lavare i pozzetti con running buffer (3-4 volte) e riempirli con il running buffer.

· Preparazione del campione:
Sapendo la concentrazione del campione dall’esperienza di laboratorio precedente (calcolata tramite lo spettrofotometro) Prelevare 20µg di proteine dal campione, diluirli 1:4 con sample buffer e scaldarlo a 95°C per 5 min. (per denaturare le proteine).

Deporre lo standard (contenente proteine di peso molecolare noto) e i campioni nei pozzetti (vol. max 10µl).

· Assemblare la cella e riempire le vaschette interna ed esterna con running buffer. Chiudere la cella con il coperchio e inserire gli spinotti nell’alimentatore.
La corsa viene effettuata a t°ambiente, per c.a. 1 ora a 180 V (la corsa è terminata quando il fronte del blu di bromofenolo arriva in fondo al gel).