bchemity: ESTRAZIONE DNA

sabato 1 ottobre 2016

ESTRAZIONE DNA - cellule HeLa

In questa esperienza in laboratorio abbiamo estratto in DNA nelle cellule tumorali HeLa
per poter estrarre il DNA bisogna lavare le cellule dal terreno di cultura e poi lisare la membrana cellulare.

Procedimento:

fare i primi due lavaggi con 3 ml di PBS,

per staccare le cellule dal fondo della piastra abbiamo usato 300µl di tripsina,
dopo tolta la tripsina si aggiungono 2 ml di PBS,

si porta tutto il contenuto dalla piastra nell'eppendorf,
si effettua la prima centrifugazione a 300 rmp,

si elimina il surnatante con una Gilson,
per eliminate le impurezze dal DNA si aggiungono 200µl di PBS
20µl di proteinasi K,
200µl di Buffer AL (Lysis Buffer),
si riscalda a 56°C, si centrifuga per un minuto (o vortex per 10 min)

si elimina il surnatante e si aggiunge 200µl di etanolo assoluto,
si trasferisce il contenuto in un eppendorf fornita dal kit, centrifughiamo per 1 minuto al massimo dei giri,

si aggiungono 500µl AN1, centrifuga 1 minuto a 800rpm, si toglie il surnatante,
si aggiunge 500µl Buffer AN2 si centrifuga per 3 minuti a 800rpm,

si rimuove l'eppendorf con il surnatante e si mette una nuova eppendorf,
200µl Buffer AE e su lascia agire per 1 minuta a temperatura abbiente,
si centrifuga per 1 minuto a 800 rpm per ottenere il DNA nella soluzione.

CULTURE FLUORESCENZA

Utilizzando un'altra piastra con le cellule HeLa si possono vedere le cellule tumorali in fluorescenza.

Procedimento:

in questo caso si procede sotto cappa laminare,
si toglie il terreno di cultura e si rimette il terreno fresco (3 ml)
si mettono 150µl di terreno vuoto (senza siero) in una eppendorf, con 2µl di DNA e 25µl di polyfect transfection reagent, dopo 5 minuti lo trasferiamo goccia goccia sulla piastra
si porta la nostra piastra in incubatore per 24 ore a 37°C e CO2 controllata.