In questa giornata di laboratorio abbiamo evidenziato le
bande immunoreattive.
Procedimento:
- Incubazione (in oscillazione) della membrana con Albumina Serica Bovina (BSA) 1% in PBS con 0,05% TWEEN 20 (c.a. 1 dito) per 45 min. a temperatura ambiente.
- 2 lavaggi in PBS con 0,05% TWEEN 20 della durata di 5 min. ciascuno.
- Incubazione con streptavidina coniugata con la perossidasi (HRP) 1:10000 in PBS con 0,05% TWEEN 20 per 45 min. a temperatura ambiente.
- 3 lavaggi in PBS con 0,05% TWEEN 20 della durata di 5 min. ciascuno.
- Sviluppo con 4-Cloro Naftolo.
Preparazione
della soluzione stock di 4-Cloro Naftolo in Etanolo: Solubilizzare una
compressa di 4-Cloro Naftolo da 30 mg in 10 ml di Etanolo (ATTENZIONE: Lavorare
sotto cappa chimica).
Preparazione
della soluzione di sviluppo:Aggiungere 5 ml della soluzione stock di
4-Cloro Naftolo in Etanolo a 20 ml di TRIS-HCl
0,05 M pH 6,8 e 7µl di H2O2 30% (ATTENZIONE:
Lavorare sotto cappa chimica).
La soluzione
così preparata va utilizzata immediatamente e per il tempo strettamente necessario
ad evidenziare gli immunocomplessi antigene-anticorpo (colorazione blu-violacea
delle bande immunoreattive); terminato lo sviluppo va allontanata e la membrana
lavata più volte con acqua ultrapura per
allontanare i residui della soluzione di sviluppo.
Autori: Roberta e Sara
Autori: Roberta e Sara
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