ELETTROFORESI SDS PAGE

Dopo aver calcolato la concentrazione delle proteine nel campione le andiamo a separare.

Ogni proteina ha un determinato peso molecolare, perciò le separeremo in base a questo.

L'elettroforesi è una tecnica che permette di separare molecole presenti in soluzione in forma ionizzata, applicando un campo elettrico. La separazione si basa sulla loro differente velocità di migrazione, queste molecole possono essere proteine, amminoacidi, acidi nucleici, nucleotidi o peptidi.

Noi abbiamo fatto l’elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) utilizzando il sodio dodecil solfato (SDS). L’SDS elimina la differenza di carica elettrica e la forma delle proteine, il questo modo possiamo separarle solo in funzione del loro peso molecolare.

PROCEDIMENTO:

·         Assemblare i vetrini per creare la camera dove dovrà essere versata la soluzione

·         Preparare il Separating Gel (12%gel - 0,375 Tris pH8,8)

Acqua	3,35ml
Tris-Hcl1,5M pH8,8	2,5ml
SDS 10% w/v	100µl
Soluzione acrilamide/bis	4ml
Ammonio persolfato 10%	50µl
TEMED	5µl
	V tot ≈ 10ml

Attenzione: L’Ammonio persolfato e il TEMED sono rispettivamente il catalizzatore e l’iniziatore della reazione di polimerizzazione e la loro aggiunta farà subito iniziare la formazione dei legami tra i monomeri di acrilamide e tra questi e la bis, quindi vanno aggiunti per ultimo e bisogna procedere rapidamente a versare la soluzione tra i vetrini.

·         Versare il Separating Gel tra i due vetrini fino ad arrivare a c.a. 1 cm sotto al limite inferiore del pettine.
Sopra alla soluzione poniamo Isobutanolo saturo con acqua per eliminare le bolle e far in modo che il gel sia livellato perfettamente.
Il tempo di polimerizzazione è di c.a. 1 ora.

·         Finita la polimerizzazione togliere l’isobutanolo aspirandolo con una Pipetta Pasteur e asciugare le pareti con un pezzo di carta assorbente.

·         Preparare lo Staking Gel (4%gel - 0,125M Tris pH 6,8)

Acqua	6,1ml
Tris-Hcl0,5M pH6,8	2,5ml
SDS 10% w/v	100µl
Soluzione acrilamide/bis	1,33ml
Ammonio persolfato 10%	50µl
TEMED	10µl
	V tot ≈ 10ml

·         Agg. Lo Staking Gel fino all’orlo della camera e inserire il pettine per creare i pozzetti dove andremo poi a depositare i campioni da separare.

·         A polimerizzazione avvenuta estrarre il pettine facendo attenzione a non rompere i pozzetti. Lavare i pozzetti con running buffer (3-4 volte) e riempirli con il running buffer.

·         Preparazione del campione:
Sapendo la concentrazione del campione dall’esperienza di laboratorio precedente (calcolata tramite lo spettrofotometro) Prelevare 20µg di proteine dal campione, diluirli 1:4 con sample buffer e scaldarlo a 95°C per 5 min. (per denaturare le proteine).

• Deporre lo standard (contenente proteine di peso molecolare noto) e i campioni nei pozzetti (vol. max 10µl).

·         Assemblare la cella e riempire le vaschette interna ed esterna con running buffer. Chiudere la cella con il coperchio e inserire gli spinotti nell’alimentatore.
La corsa viene effettuata a t°ambiente, per c.a. 1 ora a 180 V (la corsa è terminata quando il fronte del blu di bromofenolo arriva in fondo al gel).

·         Terminata la corsa elettroforetica il gel viene lavato con acqua e quindi fissato per 1 ora.

Fissaggio per colorazione con Coomassie Brilliant Blue:

Metanolo        40%

Acido acetico  10%

Acqua               50%

Il gel viene poi colorato con Coomassie Brilliant Blue.

Come fare l'elettroforesi SDS Page --> Video



Autori: Roberta e Sara

Inizia la corsa!

Bello questo gel...

Preparazione della cella

Momenti di pazzia... XD

 

Maria Emilia che controlla la corsa!

DETERMINAZIONE DELL'ETANOLO - metodo enzimatico spettrofotometrico

In questa esperienza determiniamo la concentrazione di etanolo presenti nei nostri lieviti,
Il principio del metodo che abbiamo utilizzato, è di ossidare tutto l'etanolo presente ad acetaldeide con nicotamide-adenina dinucleotide (NAD). La reazione viene catalizzata da alcool deidrogenasi.

L'acetaldeide viene ossidata in fine ad acido acetico in presenza di aldeide deidrogenasi.

Il NADH formatosi viene misurato per via spettrofotometrica, misurando l'assorbanza a 334, 340 o 365 nm.
questa esperienza è stata fatta con reagenti già preparati, il pacchetto formato da:

• bottiglia da 100 ml di soluzione contenente tampone fosfato a pH 9
• 30 compresse che contengono 4 mg di NAD e 08 U di aldeide deidrogenasi 
• bottiglia che contiene 1,6 ml di sospensione id alcool deidrogenasi

Preparazione dei reagenti.

usare il contenuto della prima bottiglia non diluito, sciogliere (in una provetta) una compressa di NAD in 3 ml della soluzione della prima bottiglia. preparare 1 provetta per ogni prova. 

	Bianco	Standard	Campione
Miscela di reazione 2	3,000 μl	3,000 μl	3,000 μl
Acqua distillata	0,100 μl	˗	˗
Campione	˗	˗	0,100 μl
Sol. Std di etanolo 0,058 g/l	˗	0,100 μl	˗
Agitare, dopo 3 min. leggere assorbimento a 340 nm e agg.
Sospensione	0,050 μl	0,050 μl	0,050 μl

Dopo circa 10 minuti la reazione è completamente avvenuta si legge l'assorbanza. Per far si che la nostra lettura sia accurata il campione non deve contenere più di 0,060 g/l di etanolo, se supera questa concentrazione bisogna diluirlo.















Per concludere l'esperienza abbiamo calcolato la concentrazione nello standard e nel campione.

Autori: Roberta e Sara