DIGESTIONE DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE

In questa esperienza useremo enzimi di restrizione Alu1 (taglia sequenza composta da 4 nucleotidi specifici).
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Per preparare la digestione servono:

• 1µg DNA              20µl DNA (50µg/x)          50 mg/µl =>1000 mg 
• 1 x Buffer               5µl Buffer
• 1 µg Alu                 1µl enzima 
• 50µl H₂O   finali  24µl H₂O

Quindi nell'eppendorf si aggiunge per primo il volume più grande al più piccolo.

• si centrifuga per un minuto
• si riscalda a 37°C per un ora (questo attiverà l'enzima e a fare in modo che tagli le sequenze)

Nel frattempo si prepara il gel di agarosio per l'elettroforesi. Si pesano 1,4 g di agarosio e 70 ml di T.A.E. (TRIS, HCl e EDTA) diluito, Si prelevano 10 ml di TAE 50x e si porta a volume di 500 ml.

Si scalda la beuta contenente 1,4 g di gel e 70 ml T.A.E., finché l'agarosio non si è sciolto completamente, versare il liquido nella vaschetta elettroforetica, si tolgono le bolle in superficie e si lascia solidificare. 

 Si prepara i campioni per l'elettroforesi:

1. campione PCR; 18 µl DNA + 2 µl di loading
2. campione con enzima di restrizione: 18 µl DNA + 2 µl di loading

Caricare sul gel 20 µl dei campioni nei pozzetti. Si far partire l'elettroforesi a 80 Volt per c.a. 20 minuti.

Autori: Roberta e Sara

CONCENTRAZIONE DNA ESTRATTO E PCR

Concentrazione DNA

DNA Estratto

Dopo aver estratto il DNA dalle cellule lo abbiamo quantificato determinando la concentrazione con lo spettrofotometro.

Gli acidi nucleici del DNA assorbono la luce UV con un picco di assorbimento ad una lunghezza d’onda di 260 nm.

PROCEDIMENTO:

• Prelevare 0,98ml di H₂O Milli-Q e metterla in un’eppendorf.
• Prelevare 2µl di DNA precedentemente estratto ed aggiungerlo nell’eppendorf con l’H₂O.
• Preparare il “Bianco” con 1ml di H₂O Milli-Q.
• Misurare allo spettrofotometro.

50µg di DNA hanno un’assorbanza pari a 1

Calcolare la concentrazione facendo il rapporto

1 : 50 µg = (assorbanza campione) : X

La X ricavata è la quantità di DNA, espressa in µg, contenuta nel campione.

Trovare la concentrazione µg /µl

X · 500 (fattore di diluizione) : 1000 (conversione da L a ml)

PCR (Reazione a Catena dellaPolimerasi)

La PCR è una tecnica che permette di ottenere “in vitro” numerose copie di un particolare tratto di DNA di interesse a partire da una preparazione eterogenea di DNA.

Per far avvenire la reazione è necessario avere:

DNA di partenza.
- Una Polimerasi termoresistente in grado di funzionare anche a temperature elevate (la più comune è la Taq polimerasi, isolata dal batterio Thermophilus Aquaticus).
- Desossiribonucleotidi trifosfati (dNTP) da polimerizzare.
- Due Oligonucleotidi sintetici di 20-30 nucleotidi (primer) che funzionano da inneschi della reazione. - Questi indirizzano la polimerasi a sintetizzare una regione specifica di DNA.

PROCEDIMENTO:

• Portare il DNA a conc. 50ng/ µl
• Mettere la diluizione in un’eppendorf.
• Mettere in una nuova eppendorf:

	V da agg.
100ng DNA 0,1 µg	2 µl
1 x Buffer 10x	5 µl
200µM dNTP (10nM)	1 µl
0,2µM Primer Forward (10µM)	1 µl
0,2µM Primer Reverse (10µM)	1 µl
2,5µl Taq polimerasi	2,5 µl

Volume finale = 50 µl (volume raggiunto con H₂O)

• Mettere prima l’H₂O Milli-Q (37,5 µl) , poi tutto il resto, mettendo per ultimo l’enzima Taq polimerasi.
• Mettere l’eppendorf nella macchina per la PCR.

PCR

Guardiamo al microscopio a fluorescenza le cellule Hela preparate la volta precedente.

Autori: Roberta e Sara

Cellule viste al microscopio a Fluorescenza

ESTRAZIONE DNA - cellule HeLa

In questa esperienza in laboratorio abbiamo estratto in DNA nelle cellule tumorali HeLa
per poter estrarre il DNA bisogna lavare le cellule dal terreno di cultura e poi lisare la membrana cellulare.

Procedimento:

• fare i primi due lavaggi con 3 ml di PBS,

• per staccare le cellule dal fondo della piastra abbiamo usato 300µl di tripsina,
• dopo tolta la tripsina si aggiungono 2 ml di PBS,

• si porta tutto il contenuto dalla piastra nell'eppendorf, 
• si effettua la prima centrifugazione a 300 rmp,

  

• si elimina il surnatante con una Gilson,
• per eliminate le impurezze dal DNA si aggiungono 200µl di PBS
• 20µl di proteinasi K,
• 200µl di Buffer AL (Lysis Buffer),
• si riscalda a 56°C, si centrifuga per un minuto (o vortex per 10 min)

• si elimina il surnatante e si aggiunge 200µl di etanolo assoluto,
• si trasferisce il contenuto in un eppendorf fornita dal kit, centrifughiamo per 1 minuto al massimo dei giri,

• si aggiungono 500µl AN1, centrifuga 1 minuto a 800rpm, si toglie il surnatante,
• si aggiunge 500µl Buffer AN2 si centrifuga per 3 minuti a 800rpm,

• si rimuove l'eppendorf con il surnatante e si mette una nuova eppendorf,
• 200µl Buffer AE e su lascia agire per 1 minuta a temperatura abbiente,
• si centrifuga per 1 minuto a 800 rpm per ottenere il DNA nella soluzione.

CULTURE FLUORESCENZA

Utilizzando un'altra piastra con le cellule HeLa si possono vedere le cellule tumorali in fluorescenza.

Procedimento:

• in questo caso si procede sotto cappa laminare,
• si toglie il terreno di cultura e si rimette il terreno fresco (3 ml)
• si mettono 150µl di terreno vuoto (senza siero) in una eppendorf, con 2µl di DNA e 25µl di polyfect transfection reagent, dopo 5 minuti lo trasferiamo goccia goccia sulla piastra
• si porta la nostra piastra in incubatore per 24 ore a 37°C e CO2 controllata.

Le cellule producono una proteina fluorescente che rende possibile la visualizzazione al microscopio a fluorescenza.

Autori: Roberta e Sara