DOSAGGIO DELLE PROTEINE - METODO DI BRADFORD

In questa nuova esperienza abbiamo calcolato la concentrazione delle proteine nei nostri campioni, precedentemente preparati nell'esperienza di estrazione delle proteine dal lievito. 

Il metodo da noi usato prevede l'utilizzo del reattivo di Bradford (Coomassie Brillant Blue G250, preparato in precedenza) e dello spettrofotometro.

Per iniziare abbiamo fatto una retta di taratura a concentrazioni note, quindi abbiamo perparato un bianco, e 4 standard (25, 50, 75, 100 µg) 

Preparazione del bianco

• 0,100 ml acqua
• 5 ml di reattivo di Bradford

Preparazione dei campioni

	STD 25 µg	STD 50 µg	STD 75 µg	STD 100 µg
BSA 1mg/ml	0,025 ml	0,050 ml	0,075 ml	0,100 ml
Acqua	0,075 ml	0,050 ml	0,025 ml
Reattivo di Bradford	5 ml	5 ml	5 ml	5 ml

BSA - Seralbumina bovina (proteine a conc. nota)

Preparazione del campione

•  0,090 ml di acqua
• 0,010 ml di campione
• 5 ml di reattivo di Bradford

Agitare, aspettare 5 minuti e poi effettuare la lettura allo spettrofotometro a lunghezza d'onda 595 nm

Una volta ottenuti i risultati si disegna una rette di taratura con gli standard.

Assorbanza	Concentrazioni
0,14254	0,025
0,35221	0,05
0,4952	0,075
0,53272	0,1
Ass. incognite	Conc. incognite
0,1956	0,027273938		conc. Roby
0,24432	0,036546697		conc. Sara

Trovata la concentrazione che sta in 10 ml del campione si trova quante proteine ci sono in un millilitro.

10 ml : 36,54 µ = 1 ml : x

x = (36,54 µg * 1 µl) / 10 µl = 3,654 µg/µl

Autori: Roberta e Sara

ESTRAZIONE DELLE PROTEINE DALLE CELLULE DI LIEVITO

In questa nuova esperienza abbiamo estratto le cellule di lievito dalla coltura cellulare, le abbiamo rotte ed abbiamo estratto le proteine.

Le cellule di lievito utilizzate sono Saccaromyces Cerevisiae del ceppo K310.

PROCEDIMENTO:

· Mettere  in una falcon 10ml di coltura cellulare (coltura cellulare su terreno liquido) e centrifugare a 3000G per 10 min. per separare le cellule dal terreno di coltura.

· Togliere il supernatante capovolgendo la falcon (le cellule restano compattate sul fondo) ed agg. H₂O distillata (il triplo rispetto al volume delle cellule) per togliere il residuo di terreno rimasto, mescolare le cellule e l’acqua “spipettando” con una pipetta Pasteur . Centrifugare a 3000G per 5 min. per separare le cellule dall’acqua.

· Togliere il supernatante (l’acqua) capovolgendo la falcon ed agg. Il tampone MES-TRIS a pH 6 (il triplo rispetto al volume delle cellule), mescolare “spipettando”. Centrifugare a 3000G per 5 min.

· Togliere il supernatante (il tampone) capovolgendo la falcon ed agg. Glass beads (microsfere di vetro) in ugual volume rispetto alle cellule e, tampone MES-TRIS a pH 6, PI e PMSF in rapporto 98:1:1 il doppio rispetto al volume delle cellule. Miscelare nel vortex per 8 min. alternando 30 secondi nel vortex e 30 secondi in bagno di ghiaccio.

· Aspirare la parte liquida poggiando la pipetta Pasteur sul fondo della falcon (per non aspirare anche le microsfere), mettere la parte aspirata contenente cellule, proteine e tampone in una nuova falcon e centrifugare a 300G per 5 min.

Aspirare con una pipetta il supernatante contenente le proteine e metterlo in un’eppendorf.

Cellule (pellet) e Proteine (supernatante)

eppendorf con le proteine

N.B. Durante tutta la procedura tenere sempre, nei tempi morti, la falcon contenente le cellule in bagno di ghiaccio!

Bagno di ghiaccio

Semina su terreno di Saccaromices Cerevisiae K310

Autori: Roberta e Sara

PREPARAZIONE DI SOLUZIONI PER DETERMINARE LE PROTEINE NEI LIEVITI

In questa nuova esperienza in laboratorio ci sono servite diverse soluzioni, tra cui il Reattivo di Bradford G-250, il TRIS-HCl e il MES-TRIS e  Sample baffer SDS-PAGE.

Reattivo di Bradford.
Per preparare si scioglie:
-10 mg di Coomassie Brillant Blue G-250
-5 ml di etanolo al 95%
-aggiungere 10 ml di acido ortofosforico 85%
-si porta al volume di 100 ml con acqua.
Si filtra la soluzione sotto cappa chimica con un filtro a pieghe.






Il reattivo di Bradford sfrutta la spettroscopia ad assorbimento per determinare la concentrazione di proteine in composti biologici. Infatti il Coomassie BB nel campo di assorbimento visibile, ha lunghezza d’onda massima e di 465 nm, mentre se forma il complesso con le proteine la lunghezza d’onda è di 595 nm.

TRS-HCl 1,5M Ph 8,8



In un falcon si preparano 40 ml di soluzione, si pesa 7,27 g di TRIS, grazie al pHametro portiamo la soluzione a pH 8,8 con l’aggiunta di acido cloridrico, si porta a volume con 100ml di acqua.

SDS 10% in acqua

In una falcon si pesa 1 g di SDS e si scioglie in 10 ml di acqua. Questa operazione deve essere fatta con attenzione, data la natura del SDS di denaturare le cellule, quindi si utilizza la maschera e guanti!

TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8

In una falcon si preparano 40 ml di soluzione, si pesano 2,42 g di TRIS e portiamo la soluzione a pH 6,8 con acido cloridrico, e poi si porta a volume di 100 ml con acqua.

MES 50 mM / TRIS pH 6

per preparare questa soluzione si usa una falcon, si pesa 0,39 g di MES, e si porta a pH 6 con l'aggiunta di TRIS, si porta a 100 ml con l'acqua.

Per ultimo si prepara parzialmente la soluzione per denaturare i campioni, Sample baffer SDS-PAGE sec. Laemmli.

Per preparare questa soluzione si usano:

• acqua deionizzata 0,380 mL
• TRIS-HCl 0,5 M pH 6,8 0,100 mL
• glicerolo 0,080 mL
• SDS 10% 0,160 mL
• 1% blue bromofenolo 0,040 mL

solo quando viene utilizzato si aggiunge 0.040 mL di 2-mercaptoetanolo.

Autori: Roberta e Sara